免疫共沉淀概述

相關服務：Co-IP蛋白相互作用檢測服務

免疫共沉淀 (Co-IP) 是基于抗原和抗體之間的特異性相互作用研究蛋白質-蛋白質相互作用的經典方法。免疫共沉淀可用于檢測兩種已知蛋白質之間的相互作用，或使用已知蛋白質尋找與其相互作用的未知蛋白質。與其他分子間相互作用檢測方法（GST pull down等）相比，免疫共沉淀實驗的優(yōu)點是蛋白質結合是在細胞內完成的，可以反映蛋白質在自然狀態(tài)下的相互作用生物中翻譯蛋白質中誰作為模板，結果更真實可靠。

實驗原理

當細胞在非變性條件下裂解時，完整細胞中的許多蛋白質-蛋白質相互作用得以保留。如果細胞中存在XY蛋白復合物，用X（X也稱為誘餌蛋白）抗體X進行免疫沉淀，則體內與X結合的蛋白Y（Y也稱為靶蛋白）也沉淀出來。因此，將X的抗體加入細胞裂解液中以沉淀蛋白X，然后使用蛋白質印跡（WB）檢測沉淀物中蛋白Y的存在。如果有，則說明細胞內存在XY蛋白復合物，即XY蛋白相互影響。

Co-IP實驗過程

免疫沉淀實驗流程為：采集蛋白樣品-誘餌蛋白抗體沉淀誘餌蛋白-SDS-PAGE蛋白分離-WB檢測目的蛋白的存在。詳細的實驗操作流程請到《免疫共沉淀實驗操作流程及注意事項》查看。

收集蛋白質樣本

蛋白質樣品通常通過裂解細胞獲得。Co-IP實驗通常有兩種，一種是內源性蛋白質相互作用驗證，另一種是非內源性蛋白質相互作用驗證。內源性相互作用是指細胞內兩種蛋白質的相互作用，即通過質粒共轉染將兩種蛋白質轉染到同一個細胞中進行表達。表達完成后，收集細胞并裂解獲得蛋白質樣品。非內源性相互作用 兩種蛋白的相互作用發(fā)生在細胞外，即含有目的蛋白的動植物組織器官經過預處理和細胞裂解得到細胞裂解液，

沉淀誘餌蛋白

用磁珠偶聯(lián)抗體沉淀誘餌蛋白：在樣品中加入磁珠偶聯(lián)抗體，抗體會與誘餌蛋白結合。用磁鐵將磁珠拉下來，誘餌蛋白會一起沉淀。如果有目標蛋白與誘餌蛋白相互作用，也會沉淀。如果沒有針對誘餌蛋白的特異性抗體，可以對誘餌蛋白（Myc、HA、Flag等）進行標記，然后使用標記抗體沉淀蛋白。

SDS-PAGE 和 WB 檢測

得到沉淀后，需要驗證沉淀中是否存在相互作用的蛋白質。先用SDS-PAGE分離蛋白復合物，然后用WB檢測目標蛋白的存在（如果已知目標蛋白的分子量，可以直接用SDS-PAGE檢測目標蛋白的存在） ）。

實驗控制設置

為了保證*終的結果是自然狀態(tài)下的交互，而不是某些方面造成的人為交互（即“誤報”），在Co-IP的實驗設計過程中，需要設置正確的控制。

假設Co-IP實驗的實驗組為“磁珠+抗X抗體+靶蛋白X+靶蛋白Y”，可能出現(xiàn)的“假陽性”和需要設置的相應實驗對照如圖所示下表：

可能的“誤報”需要設置對照實驗

磁珠和蛋白質 X 非特異性結合

“磁珠+抗體X+抗體Y”

磁珠與蛋白 Y 的非特異性結合

“磁珠+蛋白Y”

抗 X 抗體和 Y 非特異性結合

“磁珠+抗體X+蛋白Y”

抗 X 抗體（或磁珠）將與細胞裂解物中的其他蛋白質結合

“磁珠 + 抗體 X + 宿主細胞裂解物生物中翻譯蛋白質中誰作為模板，無需質粒轉染”

抗體的非特異性結合

“正常 IgG+蛋白 X+蛋白 Y”

上述為避免“假陽性”的對照稱為陰性對照。除Co-IP實驗外，還將設立陽性對照組（Input group）。Input 組直接使用抗體 X（抗體 Y）進行細胞裂解。執(zhí)行 WB 測試以驗證細胞裂解物中是否存在蛋白質 X（抗體 Y）。

在一些Co-IP實驗中，實驗者會對IP后的上清液進行蛋白X和蛋白Y的WB檢測，這個對照組稱為輸出組。

內源性 Co-IP 實驗用于驗證兩種蛋白質是否具有已知作用。如果*終結果是肯定的，則可以證明兩種蛋白質之間存在相互作用；但如果結果是否定的，則不能證明這兩種蛋白質具有已知作用。它們之間沒有相互作用，也可能是細胞內蛋白質表達低引起的。因此，在進行內源性 Co-IP 驗證兩種蛋白質之間是否存在相互作用時，建議您先表達 Co-IP 作為對照。

免疫沉淀結果的真實性

為保證免疫沉淀實驗中實驗結果的真實性，應注意以下幾點：

免疫共沉淀技術應用

免疫共沉淀實驗可用于：

隨著蛋白質研究的深入，人們將免疫沉淀法與其他方法結合起來，并在此基礎上衍生出許多更為復雜的技術，使得分析方法更加多樣化，其應用范圍也相當廣泛。免疫共沉淀是一種用于研究蛋白質-蛋白質相互作用的技術，可應用于蛋白質復合物的研究。可以驗證蛋白質復合物的存在，進而發(fā)現(xiàn)新的蛋白質復合物；免疫共沉淀技術結合免疫印跡或質譜等方法，用于確定誘餌蛋白與靶蛋白在自然狀態(tài)下的結合，確定特定蛋白的新作用伙伴。免疫共沉淀實驗也可應用于低豐度蛋白質的富集和濃縮。

同時，免疫沉淀技術是一種比較經典的探索蛋白質間相互作用的技術，在現(xiàn)代醫(yī)學研究中具有廣泛的應用和較高的可信度。蛋白質之間的相互作用滲透到體內每一個細胞的生命活動中。生物學中的許多現(xiàn)象，如復制、轉錄、翻譯、剪切、分泌、細胞周期調控、信號轉導、中間代謝等，都受到蛋白質相互作用的影響。交互調節(jié)。有些蛋白質由多個亞基組成，蛋白質之間的相互作用尤為常見。其他蛋白質結合得非常緊密；而其他人只有短暫的互動。然而，無論發(fā)生什么樣的情況，它們都控制著大量的細胞生命活動，如細胞增殖、分化和死亡。并且通過蛋白質之間的相互作用，可以改變蛋白質在細胞內的動態(tài)特性，如底物結合特性、催化活性，也可以產生新的結合位點，從而改變蛋白質對蛋白質的特異性。基質。它可以滅活其他蛋白質并調節(jié)其他基因的表達。因此，只有讓蛋白質之間的相互作用順利進行，才能保證細胞的正常生命活動。由于蛋白質之間的相互作用具有如此重要的意義，對其檢測方法的研究也備受關注和關注。從此，關于蛋白質之間關系的研究將越來越激烈。在將來，

其他交互檢測方法