體外轉(zhuǎn)錄/翻譯 基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯一、基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯的意義二、基因體外轉(zhuǎn)錄的原理及操作三、基因體外轉(zhuǎn)錄的應(yīng)用< @四、基因體外翻譯的原理和操作五、基因體外轉(zhuǎn)錄和基因翻譯一、基因體外轉(zhuǎn)錄和基因翻譯程序繁瑣。體外操作。體內(nèi)操作研究蛋白質(zhì)和RNA方便。它需要快速方便地獲取蛋白質(zhì)和 RNA。基因的體外轉(zhuǎn)錄和翻譯。DNA模板啟動子、結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄終止子RNA聚合酶四種核糖核酸轉(zhuǎn)錄因子基因體外轉(zhuǎn)錄翻譯< @二、基因體外轉(zhuǎn)錄原理及操作1、基因體內(nèi)轉(zhuǎn)錄過程真核基因轉(zhuǎn)錄原核基因轉(zhuǎn)錄基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯二、基因體外轉(zhuǎn)錄原理及操作2、基因體外轉(zhuǎn)錄的原理 基本工作原理是以DNA為模板，在轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中一系列轉(zhuǎn)錄因子的作用下，通過RNA聚合酶合成RNA。基因體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)由 PELHAM 和 JACKSON 于 1976 年建立。體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)已逐漸成熟。基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯二、基因體外轉(zhuǎn)錄原理及操作3、基因體外轉(zhuǎn)錄操作（1） RNA聚合酶（RNA Polymerases） 常用的聚合酶是來源于噬菌體的RNA聚合酶T7、SP6、T3特異性識別模板啟動子，其轉(zhuǎn)錄效率高于大腸桿菌聚合酶。酶的來源和質(zhì)量高?；蝮w外轉(zhuǎn)錄與翻譯二、基因體外轉(zhuǎn)錄原理及操作3、基因體外轉(zhuǎn)錄操作（1）

為了確定病毒在體外轉(zhuǎn)錄和翻譯的侵襲性基因，核酶核酶是一種具有核酸內(nèi)切酶活性的RNA分子，可以特異性切割靶RNA序列。Hammerhead ribozyme 發(fā)夾核酶基因體外轉(zhuǎn)錄翻譯1、基因體外翻譯過程<@四、基因體外翻譯原理及操作2、基因體外翻譯原理 細(xì)胞游離蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)是以外源mRNA或DNA為模板，通過補(bǔ)充細(xì)胞提取物酶系統(tǒng)中的底物和能量物質(zhì)來合成蛋白質(zhì)的體外系統(tǒng)。與傳統(tǒng)的體內(nèi)重組表達(dá)系統(tǒng)相比，體外無細(xì)胞合成系統(tǒng)具有諸多優(yōu)勢，如表達(dá)對細(xì)胞有毒性作用或含有非天然氨基酸（如D-氨基酸）的特殊蛋白質(zhì)，可直接以PCR產(chǎn)物為模板，同時并行合成多種蛋白質(zhì)，進(jìn)行高通量藥物篩選和蛋白質(zhì)組學(xué)研究?；虻捏w外轉(zhuǎn)錄和翻譯<@四、基因體外翻譯的原理和操作3、基因體外翻譯系統(tǒng)（1）兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物網(wǎng)織紅細(xì)胞是從紅細(xì)胞分化而來的mrna能夠作為翻譯的直接模板，主要負(fù)責(zé)用于體內(nèi)合成大量血紅蛋白（90%以上）和球蛋白。開展高通量藥物篩選和蛋白質(zhì)組學(xué)研究?；虻捏w外轉(zhuǎn)錄和翻譯<@四、基因體外翻譯的原理和操作3、基因體外翻譯系統(tǒng)（1）兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物網(wǎng)織紅細(xì)胞是從紅細(xì)胞分化而來的，主要負(fù)責(zé)用于體內(nèi)合成大量血紅蛋白（90%以上）和球蛋白。開展高通量藥物篩選和蛋白質(zhì)組學(xué)研究?；虻捏w外轉(zhuǎn)錄和翻譯<@四、基因體外翻譯的原理和操作3、基因體外翻譯系統(tǒng)（1）兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物網(wǎng)織紅細(xì)胞是從紅細(xì)胞分化而來的，主要負(fù)責(zé)用于體內(nèi)合成大量血紅蛋白（90%以上）和球蛋白。

這種未成熟的紅細(xì)胞本身沒有細(xì)胞核，但保留了這種高效翻譯各種核酸信息的能力，可以減少背景，即使在較低豐度下也能更有效地合成產(chǎn)物。根據(jù)測定，體外合成外源蛋白的效率接近完整網(wǎng)織紅細(xì)胞自身合成內(nèi)源蛋白的效率。此外，網(wǎng)織紅細(xì)胞系統(tǒng)中很少有內(nèi)源性核酸酶，有助于長鏈RNA（包括帶帽或不帶帽的RNA）的穩(wěn)定性，因此可以合成更大的蛋白質(zhì)。網(wǎng)織紅細(xì)胞系統(tǒng)是*有前途的微粒體糖基化系統(tǒng)?；蝮w外轉(zhuǎn)錄與翻譯<@四、基因體外翻譯的原理與操作3、

通過添加犬微粒體膜，可以實現(xiàn)信號肽切除和蛋白質(zhì)糖基化等翻譯后加工事件?；蝮w外轉(zhuǎn)錄與翻譯<@四、基因體外翻譯原理及操作3、基因體外翻譯系統(tǒng)（1）兔網(wǎng)織紅細(xì)胞系統(tǒng)體外翻譯系統(tǒng)真核體外 應(yīng)用*廣泛的翻譯系統(tǒng)之一，常用于較大mRNA種類的鑒定、基因產(chǎn)物特性的分析、轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控的研究以及共翻譯加工的研究。體外轉(zhuǎn)錄與翻譯<@四、基因體外翻譯原理與操作3、基因體外翻譯系統(tǒng)（< @2）小麥胚芽提取物小麥胚芽提取物是通過研磨小麥胚芽，離心去除細(xì)胞殘留物，上清液通過層析分離出抑制翻譯的內(nèi)源氨基酸和植物色素。提取物經(jīng)微球菌核酸酶處理，破壞內(nèi)源性mRNA，大大降低翻譯背景。能量產(chǎn)生系統(tǒng)和磷酸肌酸激酶被添加到提取物中。亞精胺以增加擴(kuò)鏈效率mrna能夠作為翻譯的直接模板，并加入一定量的醋酸鎂。小麥胚芽提取系統(tǒng)可以穩(wěn)定表達(dá)兔網(wǎng)織紅細(xì)胞系統(tǒng)中某些翻譯受抑制的DNA基因?；虻捏w外轉(zhuǎn)錄和翻譯<@四、基因體外翻譯的原理和操作3、基因體外翻譯系統(tǒng)（<

由于內(nèi)源性mRNA很少，因此該系統(tǒng)可用于各種病毒、酵母、高等植物甚至哺乳動物的蛋白質(zhì)合成。當(dāng)表達(dá)產(chǎn)物與球蛋白（12-15kD）難以區(qū)分時，或者表達(dá)產(chǎn)物可能只是一種蛋白質(zhì)，如哺乳動物細(xì)胞中豐富但植物中沒有的調(diào)節(jié)因子，或者當(dāng)它不能表達(dá)時不明原因。試試麥芽提取系統(tǒng)。但是請記住，該系統(tǒng)需要 RNA 具有帽結(jié)構(gòu)才能更好地翻譯。如果以上條件不能對RNA加帽，就得用大腸桿菌系統(tǒng)基因體外轉(zhuǎn)錄翻譯<@四、基因體外翻譯原理及操作3、基因體外翻譯系統(tǒng)（3）@ > 細(xì)菌提取coliCell-Free System 原核系統(tǒng)主要使用大腸桿菌提取物進(jìn)行表達(dá)。使用大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)行體外表達(dá)，某些蛋白質(zhì)每小時每個反應(yīng)（50ul）可能高達(dá)數(shù)百微克。在優(yōu)化的批量系統(tǒng)中，*終的蛋白質(zhì)產(chǎn)量也有可能達(dá)到 1mg/ml，而這個產(chǎn)量可以通過連續(xù)反應(yīng)器進(jìn)一步提高。人們可以根據(jù)需要添加蛋白酶抑制劑、分子伴侶、代謝物、非天然氨基酸甚至非天然氨基酸等特殊添加劑。也可以將少量的變性劑摻入特殊標(biāo)記的氨基酸中，以獲得標(biāo)記的蛋白質(zhì)。這樣一來，這個系統(tǒng)的靈活性就非常大了，還可以加入很多其他優(yōu)化的成分來提高收率，提高溶解度。大腸桿菌的原料來源成本*低，實用性強(qiáng)，表達(dá)效率高?；蝮w外轉(zhuǎn)錄與翻譯<@四、基因體外翻譯原理及操作3、基因體外翻譯系統(tǒng)（3）@>細(xì)菌提取物coliCell-Free System s30原核大腸桿菌s30提取物體外翻譯系統(tǒng)的E.coli B菌株是由OmpT內(nèi)切蛋白酶和Lon蛋白酶缺陷的E.coli B菌株制備的，因此在s30系統(tǒng)中表達(dá)基因可以增加產(chǎn)品的穩(wěn)定性，特別適合蛋白酶體外表達(dá)。降解的蛋白質(zhì)。

s30體外翻譯系統(tǒng)也適用于表達(dá)那些在體內(nèi)表達(dá)時由于宿主編碼的抑制性酶而導(dǎo)致表達(dá)水平較低的蛋白質(zhì)，使它們可以高水平表達(dá)。s30 系統(tǒng)還可用于轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控的研究。此外，s30體外翻譯系統(tǒng)的應(yīng)用還包括形成少量標(biāo)記蛋白作為蛋白質(zhì)純化中的示蹤劑，以及在蛋白質(zhì)中摻入非天然氨基酸用于蛋白質(zhì)的體外轉(zhuǎn)錄和翻譯研究結(jié)構(gòu)和功能基因<@四、基因體外翻譯的原理和操作3、基因體外轉(zhuǎn)錄和翻譯<@四、 該序列位于 AUG 上游，與 30S 核糖體亞基的 16s rRNA 序列互補(bǔ) 保守區(qū) 5′-UAAGGAGGUGA-3′，核糖體結(jié)合位點 RBS 與起始密碼 AUG 之間的距離，堿基組成有顯著影響翻譯效率。設(shè)計時要注意。

真核生物中的保守序列成為 Kozak 序列 (5′-GCCACCAUGG-3′)。對于高效的翻譯，+1G 和-3A 非常重要。然而，如果 mRNA 沒有這個 Kozak 序列并且具有適當(dāng)?shù)?5′UTR 長度，它也可以在無細(xì)胞系統(tǒng)中有效翻譯?；蝮w外轉(zhuǎn)錄與翻譯<@四、基因體外翻譯原理及操作3、基因體外翻譯系統(tǒng)（5）基因體外轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄鏈接 基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯五、基因體外翻譯應(yīng)用1、基因產(chǎn)物檢測是目前*常見的應(yīng)用，獲得DNA序列后，通過起始密碼子ATG（少數(shù)情況下為GTG）和終止密碼子（TAA、TAG） . 或 TGA) 初步判斷為開放閱讀框 (ORF)。使用快速體外表達(dá)可以快速判斷序列是否有表達(dá)產(chǎn)物、表達(dá)產(chǎn)物特征等第一手信息。這種方法對于一次檢測多個 ORF 產(chǎn)品特別有用 方便?；蝮w外轉(zhuǎn)錄和翻譯五、基因體外翻譯的應(yīng)用 預(yù)合成的高通量蛋白表達(dá)和純化通常在體外表達(dá)后體內(nèi)表達(dá)，因為體外表達(dá)可以表達(dá)一些強(qiáng)毒性、敏感性水解或不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。此外，體外表達(dá)的另一個優(yōu)點是在合成過程中可以插入具有光敏性、熒光性或生物素殘基的標(biāo)記，以促進(jìn)蛋白質(zhì)定位。

基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯五、基因體外翻譯應(yīng)用高通量篩選?篩選病毒特異性翻譯抑制復(fù)合物?篩選分子伴侶抑制劑以識別新的孤兒受體基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯五、基因體外翻譯的應(yīng)用 膜蛋白研究 已有實驗證明，在體外表達(dá)系統(tǒng)中加入犬微粒體膜，可以讓跨膜蛋白G蛋白偶聯(lián)受體正確折疊。添加非天然氨基酸進(jìn)行標(biāo)記實驗表明，帶有賴氨酸反密碼子的修飾tRNA可以將非天然氨基酸插入體外表達(dá)的合成多肽中。聚合物組裝基因的體外轉(zhuǎn)錄和翻譯 < @五、 基因體外翻譯應(yīng)用蛋白質(zhì)截斷試驗（Protein truncation test，PTT） 這個實驗發(fā)明于1993年，可以快速檢測基因突變?；蝮w外轉(zhuǎn)錄與翻譯五、基因體外翻譯應(yīng)用功能基因組學(xué)?體外表達(dá)克隆核糖體展示、RD基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯五、基因體外翻譯應(yīng)用酶活性分析部分蛋白仍表達(dá)體外 保持活性，因此這些樣品可用于酶活性測定。如果體外表達(dá)系統(tǒng)中所含的酶活性與待測酶不同，則表達(dá)產(chǎn)物可不經(jīng)純化直接進(jìn)行檢測。此外，可以方便地將一些外部因素加入到體外表達(dá)系統(tǒng)中，

翻譯后修飾分析 許多蛋白質(zhì)在形成和發(fā)揮功能之前需要進(jìn)行高級修飾。目前，已經(jīng)在兔網(wǎng)織紅細(xì)胞系統(tǒng)中成功地進(jìn)行了過度磷酸化、腺苷酸化、肉豆蔻?；?、法呢化、異戊二烯化和蛋白水解活性修飾。額外的微粒體膜可用于研究糖基化、甲基化和信號序列去除?；蝮w外轉(zhuǎn)錄和翻譯五、 基因體外翻譯蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的應(yīng)用。這些作用包括特異性結(jié)合（例如抗原-抗體、配體-受體結(jié)合）、大分子組裝和轉(zhuǎn)錄功能復(fù)合物的形成。通常相互作用蛋白分別通過體內(nèi)表達(dá)系統(tǒng)和體外表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)，體外表達(dá)可以方便地標(biāo)記蛋白質(zhì)，并作為探針檢測另一種蛋白質(zhì)。該方法也可用于驗證酵母雙雜交的結(jié)果。蛋白質(zhì)-DNA和蛋白質(zhì)-RNA相互作用表達(dá)的蛋白質(zhì)可以通過電泳遷移率變化分析（EMSA）來發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)是否可以與核酸結(jié)合，結(jié)合的蛋白質(zhì)會移動得更慢。DNA-RNA 和 RNA-RNA 與互補(bǔ)核酸序列的相互作用會抑制轉(zhuǎn)錄或翻譯的進(jìn)程。基因的體外轉(zhuǎn)錄和翻譯，課后復(fù)習(xí)1、體外轉(zhuǎn)錄常用的RNA聚合酶2、體外轉(zhuǎn)錄模板DNA的來源和要求3、體外翻譯常用的翻譯系統(tǒng)4、